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使用非对称流场 - 流动分级AF4和光散射探测亚微米蛋白质聚集

发布时间:2019-03-15 16:07 来源:未知 编辑:admin

  光散射仪器普遍用于表征溶液中的​​大颗粒和纳米颗粒。它供给了利用多角度光散射(MALS),差示粘度丈量,场流分级(FFF),动态光散射(DLS),电泳迁徙率和确定绝对摩尔质量,大小,构象,电荷和彼此感化的尖端东西。成分渐变。

  Wyatt在仪器和软件方面的最新成长使FFF的全数潜力可认为更普遍的用户群所用。在此次采访中,Kim R. Williams和Christoph Johann就新手艺及其研究与旧事 - 医学和生命科学进行了交换。

  FFF最凸起的特点是什么?我们为什么要利用FFF?

  起首,我们该当回首一下FFF最凸起的特点。FFF按照尺寸物理分手样品,因而它答应我们收集馏分。利用Eclipse FFF系统,我们能够将实体从仅几纳米到几微米的尺寸分隔。此外,该手艺暖和,施加低剪切力,而且长短粉碎性的。

  当与MALS连系利用时,FFF出格无效,MALS供给洗脱级分的绝对摩尔质量和大小。由于它连系了基于尺寸的分手和在线光散射,所以它具有比尺度批量或未分级DLS更高的分辩率。

  此外,我认为支撑离线方式开辟的新SCOUT DPS软件是一个令人兴奋的附加功能。该软件最大限度地削减了方式开辟所需的尝试数量。只需少量打针即可获得最佳成果,而不是在尝试室中破费数小时。

  从FFF尝试中获得什么类型的数据?

  我们能够从每个洗脱体积的多角度光散射阐发中获得绝对摩尔质量和RMS半径的细致分布。此外,我们能够通过动态光散射计较每个洗脱体积的流体动力学半径,或者从FFF保留时间得出它。

  对于大分子,浓度来自UV或折射率检测器以获得定量分布,而对于纳米颗粒,颗粒浓度的分布仅通过光散射来量化。

  您若何确保卵白质不与AF4膜彼此感化?

  主要的是要验证卵白质与AF4中利用的膜之间没有彼此感化,出格是当AF4用于从保留时间计较粒径时。

  我认为在没有交叉流动的环境下进行初始运转老是明智的,以确保注入足够的样品而且在检测器中获得很是大的峰值。若是您发觉本人处于完全样品丢失的严峻环境,您能够通过降低场强或交叉流速来改正它。

  通过预处置膜,例如通过注入卵白质溶液,或通过削减盐负荷,也能够削减彼此感化。我发觉50毫摩尔氯化钠溶液,以至没有插手盐的磷酸盐缓冲液都能够提高FFF的分辩率和收受接管率。您不必老是利用含有150毫摩尔氯化钠的PBS缓冲液,这在体积排阻色谱MALS中很常见。

  我认为最主要的是Eclipse FFF易于利用,同时又是一个强大而强大的系统。它连系了三个环节特征:无缝集成;完整系统的完全主动化和普遍的数据处置能力。

  可以或许利用新的VISION CSH软件平台将完整的工作流程从方式开辟集成到最终成果很是棒。这包罗用于仪器节制和运转尝试的VOYAGER CDS使用法式以及用于数据处置和方式开辟的SCOUT DPS使用法式。

  我但愿我们在仪器和软件方面的新成长将使更多用户可以或许获得FFF的全数潜力。

  若何利用SCOUT进行方式开辟?

  SCOUT协助我们选择准确的流程法式以实现所需的分手。我们只需要将我们想要的通道几何外形和假定的样品粒度范畴输入到SCOUT中,成立一个标称流法式,而且通过它能够间接给出一个预测的分形图。

  流程法式包罗通道流速和横流速度随时间的演变。估计的峰值当即显示其计较的保留时间,而且它还给出了峰值稀释度。我们能够更改参数,例如通道长度或流速,以查看结果。这一切都很快就由软件决定,为我们节流了大量的尝试时间。

  按照我们的经验,SCOUT预测很是精确,而且紧跟现实尝试的UV踪迹。

  通过这种体例,我们能够间接找到一种可以或许供给合适分辩率的方式。一旦我们选择了合适的方式,我们就能够将它导出到VOYAGER,它将运转尝试。

  FFF若何协助领会抗体的堆积动力学?阐发生物药物有哪些挑战?

  常规药物凡是是配制成具有长保质期的片剂的胶囊的小分子。比拟之下,生物医治药物或生物药物是形态上异质的大型复杂分子。

  它们在溶液中配制并通过打针器打针或静脉内输注施用。与他们的阐发相关的次要挑战源于他们往往不不变且对压力敏感的现实。

  因而,对我们来说,利用不会使生物药物降解或变性的阐发过程很是主要。有多个加工步调和应激源可导致不成逆的变性,例如温度,pH和溶液构成。

  若是抗体单体变性,则发生堆积和沉淀,这将在打针入患者时降低其功能并添加其免疫原性的可能性。区分这些卵白质堆积体和可能的外来污染物也很主要,例如硅油微滴,气泡,以至玻璃碎片或橡胶碎片。

  哪种手艺可用于表征卵白质堆积体?

  利用的手艺现实上取决于卵白质的大小。对于跨越一微米的卵白质,具有几种手艺,可是用于阐发纳米至一微米范畴内的卵白质的手艺很是少。

  尺寸排阻色谱(SEC)是目前最常用于察看卵白质堆积体的方式,但它并不抱负。起首,流动相构成是无限的,这最大限度地削减了柱填料概况上的接收。其次,可用的孔径限制了每个柱能够分手的尺寸范畴。

  第三,填充柱将导致剪切降解,这在研究瞬态堆积体时特别成问题。最初,为避免色谱柱堵塞,凡是会对样品进行过滤或超离心分手,而且不晓得在此过程中能否断根了哪些样品。

  我们开辟了一种基于非对称流动FFF(AF4)和光散射的简单方式,以满足对SEC中丢失物质的消息的需求:较大的堆积体或在柱上经受剪切的堆积体。它使我们可以或许获得亚微米卵白质堆积体的消息。

  您能告诉我们更多关于这种方式的长处吗?

  不合错误称流动FFF涉及在没有填充材料的环境下在开放通道平分离组分。垂直于分手轴施加场以构成交叉流动。利用开放通道能够在很宽的尺寸范畴内进行分手,范畴从1纳米到数十微米。然而,我们发觉它对于104至大于108道尔顿范畴内的大分子表示最佳。

  关于载液的选择具有很大的矫捷性,由于与分手概况的彼此感化较少。

  此外,我们发觉通过调整交叉流速能够轻松调整分手,这反过来会改变场强,然后改变保留时间。

  当阐发100纳米及以上的较大阐发物(包罗抗体堆积体)时,AF4优于尺寸排阻色谱法。

  那么它若何与光散射手艺相连系呢?

  AF4中的保留时间能够与平移扩散系数相关,该平移扩散系数又能够利用斯托克斯 - 爱因斯坦方程与流体动力学半径相关。从素质上讲,AF4基于流体动力学尺寸实现了分手。

  一旦样品通过AF4进行了尺寸分手,它们就会表露在在线光散射检测器中。若是利用多角度光散射(MALS)检测器,则能够获得摩尔质量和均方根半径的丈量值。若是利用动态光散射(DLS)检测器,则能够丈量平移扩散系数,由此能够利用斯托克斯爱因斯坦方程计较流体动力学半径。

  AF4和光散射是具有主要协同能力的互补手艺。AF4可以或许取出多相多分离样品并将其分手成单分离的部门。然后,MALS和DLS供给摩尔质量和尺寸的正交丈量。能够将这些值与利用AF4理论计较的AF4值进行比力。

  AF4 MALS若何用于研究卵白质堆积动力学?

  构成卵白质堆积体有四个根基阶段。阶段1是与另一种反映性单体的部门展开和可逆缔合;第2阶段是不成逆的堆积核构成;阶段3是链聚合;第4阶段是聚合凝结。最终成果是构成可溶性高摩尔质量的亚微米物质,这恰是我们试图表征的

  Lumry-Eyring有核聚合(LENP)堆积模子供给了比以前的模子更全面的非天然堆积动力学的定量描述,由于它包含所有这些分歧的阶段。LENP模子评估三种分歧的时间标准:成核时间(tn);改变聚合的时间(tg);和凝结时间(tc)。

  利用一系列微分方程,若是单体分数和堆积体的摩尔质量能够确定为时间的函数,则能够确定tn,tg和tc。这能够通过AF4和MALS实现。

  当我们将该手艺使用于抗链霉抗生物素卵白IgG1样品时,我们看到了两个峰。第一个峰出此刻7.5分钟,这是150千道尔顿单体(相当于抗链霉抗生物素卵白IgG1的摩尔质量)。我们在大约9分钟后看到的第二个峰值是聚合物。因而,我们设法分手单体和堆积体。

  监测这些峰的大小使我们可以或许研究应激(例如热)对被监测卵白质的影响。没有加热,150千道尔顿单体只要一个峰。当施加热量时,我们看到堆积峰呈现而且跟着时间的推移其尺寸添加,由于更多的卵白质通过表露于热量而变性。然后将单体峰的大小作为应力时间的函数作图。来自AF4-MALS的数据点显示跟着应力时间添加单体丧失添加。然后,从拟合线,我们能够确定tn,tc和tg的值。

  通过这种体例,利用AF4和MALS阐发,我们曾经证明离心样品是尺寸排阻色谱之前的常见做法,它改变了每个步调的时间标准:成核步调,链聚合步调和堆积缩合步调。在抗链霉抗生物素卵白IgG1的环境下,该变化不足以改变堆积的动力学。

  AF4分手对卵白质堆积体有何影响?

  我们在热应激后和插手柠檬酸后利用FFF评估了卵白质堆积体的不变性。我们能够跟踪样本随时间的变化程度。

  我们发觉AF4聚焦步调没有发生抗链霉抗生物素卵白IgG1堆积体。然而,载体液体组合物确实影响堆积体不变性,而且在稀释期间倾向于发生堆积体缔合。

  AF4中的稀释次要发生在通道出口处,而不是在分手过程中。与尺寸排阻色谱法比拟,这可认为分手浓度敏感的阐发物供给更宽大的前提。

  AF4和尺寸排阻色谱MALS若何比力卵白质堆积研究?

  尺寸排阻色谱和AF4是基于互补尺寸的分手手艺。尺寸排阻色谱法对于小型低聚物具有更好的分辩率,而AF4更适合阐发高级摩尔质量堆积体,特别是那些易于发生剪切应力的堆积体。

  定性动力学研究表白,AF4以至能够达到20微米的堆积体,这是尺寸排阻色谱法无法实现的尺寸范畴。

  我们相信AF4 MALS能够供给​​动力学机制的主要看法,并可以或许研究堆积体的不变性。

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